激光共聚焦显微镜样品制备方法之细胞样品培养

激光共聚焦显微镜样品制备方法中，针对细胞样品的培养，主要涉及一系列精细的步骤，以确保样品能够适合在激光共聚焦显微镜下进行观察。以下是一个详细的制备过程：

一、细胞培养准备

材料选择

载玻片与盖玻片：选择质量好、光洁、无杂质且厚度适宜的载玻片和盖玻片。对于重要实验，应提前检查其光学特性，确保无荧光干扰。盖玻片的厚度一般应小于0.17mm。

玻璃处理：新购买的盖玻片需用玻璃洗液浸泡处理一天以上，再用去离子水冲洗掉残存的洗液。之后进行高温灭菌处理，并放置在细胞培养皿中备用。对于贴壁不牢的细胞或与细胞外基质相关的研究，玻璃片需预先包被细胞外基质，如poly-L-Lysine、Fibronectin、Laminin等。

细胞培养

将处理好的盖玻片放置在细胞培养皿中，并接种适量的细胞。细胞密度应根据实验需求进行调整，通常在转染前一天将细胞以一定比例（如1:4）铺在含有盖玻片的细胞培养皿中，以便细胞在D二天达到约50%的密度。

二、荧光表达载体的构建与导入

荧光表达载体的构建

构建绿色荧光融合蛋白（GFP）表达载体，将目的蛋白的cDNA通过PCR扩增后接入到荧光蛋白表达载体的多克隆位点。在设计荧光融合蛋白时，需考虑荧光蛋白的用途、种类以及插入位置（如N端、C端或定位信号序列之后）。

荧光表达载体的导入

将构建好的荧光表达载体进行大量扩增，并通过质粒抽提试剂盒纯化，得到不含有内毒素的纯化质粒。

将纯化后的质粒导入到培养细胞中，常用的转染方法包括磷酸钙转染法和脂质体介导的转染法。转染后继续培养细胞1～2天，使GFP标记的蛋白表达水平达到能被荧光显微镜检测的水平。

三、免疫荧光染色

细胞固定与通透

使用预冷的PBS缓冲溶液洗涤细胞，去除残留的培养液。

加入4%多聚甲醛（PFA）固定液，在室温下固定细胞15分钟。

用PBS洗涤残留的固定液后，用0.5% Triton X-100处理细胞5分钟，以通透细胞膜，使抗体等大分子能进入细胞内部。

封闭与抗体孵育

在含有1% BSA的PBS溶液中孵育细胞30分钟，以封闭细胞和玻璃片，减少抗体的非特异性吸附。

将一抗稀释到含有1% BSA的PBS溶液中，孵育细胞1小时或4℃过夜。抗体的使用浓度应根据抗体的性质进行调整。

用含有1% BSA的PBS溶液洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除多余的抗体。

使用荧光标记的二抗或染料稀释在含有1% BSA的PBS溶液中，室温孵育1小时。注意避免强光照射，防止荧光基团淬灭。

洗涤与封片

用PBS洗涤玻璃片，去除残留的荧光染料或抗体。

去掉玻璃片上多余的PBS，并用封片剂封片。待封片剂凝固后，即可进行激光共聚焦显微镜观察。

四、注意事项

在整个制备过程中，需保持无菌操作，避免细胞污染。

注意控制实验条件，如温度、湿度和光照等，以确保实验结果的准确性。

根据实验需求选择合适的荧光染料和抗体，以获得Z佳的观测效果。

通过以上步骤，可以制备出适合在激光共聚焦显微镜下进行观察的细胞样品。