激光共聚焦显微镜的观察方式介绍

激光共聚焦显微镜是一种先进的细胞生物医学分析仪器，它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，并使用计算机进行图像处理。以下是激光共聚焦显微镜的观察方式介绍：

一、基本原理

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作为光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上。组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像。

二、观察方式

点照明与点探测

激光光源通过照明针孔发射出的光，聚焦在样品焦平面的某个点上。

该点所发射的荧光在探测针孔上成像，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。

照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。

扫描成像

计算机以“像点”的方式将被探测点显示在计算机屏幕上。

为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上进行逐点、逐行、逐面的快速扫描。

通过控制调焦深度，可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示所观察表面的立体结构。

三维图像重建

激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。

通过“Z-Stack”模式，可以确定光学切片的位置及层数，并启动扫描，*终获得三维图像。

时间序列图像获取

“Time-Series”功能可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。

只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，即可进行实验，这对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。

三、应用优势

高分辨率与高对比度

激光共聚焦显微镜比普通荧光显微镜获得更高对比度、高分辨率图像。

能够对细胞或组织内部微细结构进行清晰成像。

多重荧光观察

可以实现多重荧光的同时观察，并可形成清晰的三维图像。

实时动态检测

可进行活体细胞或组织功能的实时动态检测，如测定细胞内钙变化、pH变化、膜电位变化等。

无损伤检测

对检测样品无损伤，具有良好的可靠性和重复性。

四、应用领域

激光共聚焦显微镜在生命科学、医学研究中应用广泛，包括但不限于：

细胞或亚细胞形态结构的研究

检测蛋白质、抗体及其他大分子

检测细胞凋亡

细胞器的观察和测定（线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体）

检测细胞融合

观测细胞骨架

检测细胞间隙连接通讯

检测细胞或组织内脂肪

细胞或组织结构的三维重构

综上所述，激光共聚焦显微镜以其独特的观察方式和广泛的应用优势，在生物医学研究中发挥着重要作用。