中科院生物物理所在超分辨显微镜研制领域取得进展，你怎么看？

哺乳动物的DNA复制是在许多复制起点开始的，这些复制起点聚集在整个基因组的数千个复制域（RD）中。然而，目前尚不清楚每个RD内的复制起源是随机激活还是优先在某些染色质特征附近激活。

一.研究介绍

为了了解单个人类细胞中的DNA复制是如何在亚RD水平上调节的，作者使用STORM以超高分辨率直接可视化和定量表征跨S期的单个复制点（RFi）的时空组织、形态和原位表观遗传特征，揭示了RFi传播动力学的分级径向模式。

结合模拟和生物信息学分析，指出了一种“CTCF组织的复制繁殖”（CoREP）模型，该模型表明早期S期亚RD水平复制激活的非随机选择机制，由CTCF有组织的染色质结构介导。这些发现为局部表观遗传环境在协调基因组DNA复制中的关键作用提供了重要的见解。

二.研究结果（节选）

在S期的特定阶段，向细胞提供染料标记的dUTP或EdU，将这些类似物分子结合到分裂期中DNA中，用STORM对标记的RFi进行成像，揭示了点状分布以及跨S期，STORM（20 nm） 提供的好的空间分辨率能够对RFi进行更准确的定量表征，特别是对于基于数十纳米内多色共定位分析的后续发现。

图1. 跨S期RFi的STORM成像和定量表征

单个HeLa细胞核中RFi的常规和STORM图像，在S期的五个不同阶段（从左到右，每个阶段有30分钟的标记）。插图（红色框）显示每个阶段单个RFi 的放大代表性图像。顶部的橙色条表示S期标记周期的相对时间位置。

为了研究以亚衍射JI限分辨率复制DNA的局部染色质环境中的动态变化，作者使用两种光谱不同的染料Alexa 647和Cy3B原位共标记RFi和与各种表观遗传特征相关的七个关键核标记，并进行双色STORM成像以量化它们的共定位。在这些标记中，已知CTCF通过形成染色质环来调节3D染色质结构，组蛋白修饰的H3K27ace和H3K4me3与转录活性染色质相关，核层定位的层粘连蛋白 A/C主要与转录抑制的DNA 相关，而SUZ12构成组蛋白H3的抑制复合物的一部分，增殖细胞核抗原（PCNA）是哺乳动物复制的重要组成部分，它与H2B一起作为阳性对照。

图2. RFi相关表观遗传特征在S期原位的动力学

（A–G）RFi和七个关键核标志物之间的共定位分析揭示RFi在整个S期的不同局部染色质状态。在S期早期（顶部），中期（中间）和晚期（底部）开始时标记的新复制DNA（粉红色）的细胞，随后用针对每个标记物（绿色）的抗体进行免疫标记，并用双色STORM成像。

为了探测单个RFi的空间组织和动力学，作者研究DNA复制在空间和时间上的传播模式。为此，在S期三个不同阶段的两个连续30分钟时间窗口内用两种光谱不同的染料Alexa 647和Atto 550标记新复制的DNA，此外，核层中的层粘连蛋白A/C用第三种染料Atto 488。在标记细胞的多色STORM成像中，两个时间窗口的相对空间分布揭示了RFi进展的独特时空模式。

图3. S期早期和晚期的RFi表现出相反的传播动力学时空模式

30分钟窗口（紫色和绿色）内新复制的DNA（紫色：第Y个窗口;绿色：第E个窗口;白色：共定位RFi）与层粘连蛋白A/C（蓝色）一起标记每个细胞的核边界。顶部的紫色和绿色条表示S期标记周期的相对时间位置。插图（编号为1到6）显示放大区域（红色框），显示两种颜色之间的正常对比度（顶部）和增强对比度（中），以获得更好的可视化效果。

为了理解RFi传播独特模式背后的机制基础，CTCF通过形成染色质环在调节3D基因组结构中发挥的突出作用，作者使用RNA干扰物降低HeLa细胞中的CTCF表达，使用免疫染色在蛋白质水平上证实了这一点，结果表明，CTCF及其介导的染色质环结构是RFi形态和传播动力学的关键调节因子。

图4. CTCF调节RFi形态和时空传播动力学

（A）用非特异性对照（NC）或CTCF siRNA转染的细胞核中S期早期RFi的STORM图像。插图（蓝色）显示了CTCF在RNA干扰下的成功下调。（D）在用NC或CTCF siRNA处理的细胞核的S期早期开始时，在两个连续的30分钟窗口（紫色和绿色）中标记的新复制DNA的双色STORM图像。

总之，作者的研究为进一步询问DNA复制和其他相关核内过程的时空组织和动力学铺平了道路，为理解复制和转录之间的耦合提供了一个框架，因为转录活性启动子周围的开放染色质可以促进附近复制起源的选择，这可能反过来解释转录活性基因倾向于早期复制的观察结果。