做超分辨显微镜实验，如何寻找到合适的荧光抗体呢？

先来聊聊目前几种常见的SRM（超分辨显微镜）技术原理：

一、受激发射耗竭（STED）显微镜

STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单，该方法和普通共聚焦显微镜（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用单光源，而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签（研究者们以此来定位和观察蛋白）的光，另一个光源发出不同波长的光，用于抑制荧光。这束光是环形的，并且与**束光有所重叠，因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

获得STED超分辨率图片并没有那么复杂，用户需要仔细调整参数，才能得到漂亮的结果，否则所得图片和普通confocal没有差别。

使用传统和RESCue受激发射减损显微镜（STED）得到的细胞核膜上核孔复合体的图片。

STED的原理：

显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域，这称为点扩散函数（PSF），由于PSF的存在，使得常规显微镜无法达到超分辨。

在普通光学显微镜中，成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制，防止了射线的精确会聚，从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数（PSF）的大小，或对象在某个点的三维强度分布。在STED中，应用环形炸弹耗尽型激光器，其零点与激发激光焦点的*大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”，从而“抑制了来自零点附近区域的荧光，导致有效PSF的尺寸减小”。

而受激发射耗竭（STED）显微镜通过限制样品的荧光区域（PSF）产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光，**个按照常规显微镜激发荧光团（图2A）。第二个激光器称为耗尽激光器（STED激光器），它激发“甜甜圈”形状的激光，其中心的零强度点非常小（?30 nm）（未激发）。除了在甜甜圈的中心处之外，第二激光起到了“关闭”**激光所产生的外圈荧光，从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处，这有效地降低了PSF，以产生非常小的单分子荧光聚焦区域，从而获得高分辨率图像。

1.单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析，从而导致图像模糊

2.STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”

3.饱和耗尽在功能上降低了激励PSF

4.随之可以解析单个蛋白质

适用于STED的荧光团偶联抗体：

为了获得超分辨率，染料必须具有STED激光波长的高发射截面，并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性，具有高的量子产率和对比度，并在目标附近具有足够的标记密度。如下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用：

Alexa Fluor 488标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，#115-545-003

与传统的荧光团相比，具有发光亮度更强，灵敏度更高，背景更低的优势，同时其对pH的稳定性更好，发光 也更持久，因此更适合于拍照。Alexa Fluor荧光荧光染料作为荧光显微镜、细胞生物学和分子生物学内的生物分子、细胞和组织标记物，可应用于生物技术和研 究等众多领域。

二、随机光学重建显微镜（STORM）

*初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签，随后使用另一束光来关闭这些荧光标签。不断重复这个过程，生成一系列部分荧光图，*后重建成整个视野的荧光图。以产生分辨率优于常规方法收集的图像。

使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

用于单分子定位实验的荧光团偶联抗体

用于单分子定位的*佳染料通常非常亮，并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。例如艾美捷Jackson 的AlexaFluor®488，AlexaFluor®647和Cy™5，可用于这些类型的实验。建议用于超分辨显微镜的荧光染料偶联物。

每种SRM技术都有各自的探针选择要求，需要注意的是，SRM领域变化迅速，因此，建议从专业技术文献中寻求信息，以帮助选择合适的荧光团。