光学显微镜的主要观察方法之荧光观察的介绍

荧光现象

荧光是指荧光物质在特定波长光照射下，几乎同时发射出波长更长光的过程。当特定波长的光照射一个分子时，光子能量被该分子的电子吸收。接着，电子从基态跃迁至较高的能级，即激发态。这个过程称为激发。电子在激发态停留10-9–10-8秒，在此过程中电子损失一些能量。电子离开激发态并回到基态的过程中，会释放出激发过程中吸收的剩余能量。

荧光分子在激发态驻留的时间为荧光寿命，一般为纳秒级别，是荧光分子本身固有的特性。利用荧光寿命进行成像的技术叫荧光寿命成像，可以在荧光强度成像之外，更加深入地进行功能性精准测量，获取分子构象、分子间相互作用、分子所处微环境等常规光学成像难以获得的信息。

荧光的另一个重要特性是Stokes位移，即激发峰和发射峰之间的波长差异。通常发射光波长比激发光波长更长。这是由于荧光物质被激发之后、释放光子之前，电子经过弛豫过程会损耗一部分能量。具有较大Stokes位移的荧光物质更易于在荧光显微镜下进行观察。

荧光显微镜及荧光滤块

荧光显微镜是利用荧光特性进行观察、成像的光学显微镜，广泛应用于细胞生物学、神经生物学、植物学、微生物学、病理学、遗传学等各领域。荧光成像具有高灵敏度和高特异性的优点，非常适合进行特定蛋白、细胞器等在组织及细胞中的分布的观察，共定位和相互作用的研究，离子浓度变化等生命动态过程的追踪等等。

细胞中大部分分子不发荧光，想要观察它们，要进行荧光标记。荧光标记的方法非常多，可以直接标记，或利用抗体抗原结合特性进行免疫染色，也可以用荧光蛋白标记目标蛋白，还可以用可逆结合的合成染料等。

目前荧光显微镜已成为各个实验室及成像平台的标配成像设备，是我们日常实验的好帮手。荧光显微镜主要分为三大类：正置荧光显微镜、倒置荧光显微镜、荧光体视镜。

荧光滤块是显微镜荧光成像的核心部件，由激发滤片、发射滤片和二向分光镜三部分组成，安装在滤片转轮里，不同的显微镜转轮位数会有区别，也有些显微镜使用滤块滑板。

滤块在荧光成像中起着重要作用：激发滤片选择激发光来激发样品，阻挡其他波长的光；通过激发滤片的光经过二向分光镜，反射后通过物镜聚焦，照射到样品，激发出对应的荧光即发射光，发射光被物镜收集，透过二向分光镜，到达发射滤片。

荧光显微镜常用荧光滤块可分为长通和带通两种类型。带通通常由中心波长和区间宽度确定。

荧光物质具有其特征性激发（吸收）曲线和发射曲线，激发峰为Z佳激发波长，发射曲线为发射荧光波长范围。因此，在实验中，我们会尽可能选择与激发峰Z接近的波长进行激发，而接收范围需包括发射峰。

滤块的详细信息可以在显微镜成像软件里看到。了解染料并找到Z匹配样品的滤块对于荧光成像有着至关重要的作用。荧光染料和荧光蛋白的光谱信息一般在说明书中会注明，也可在网上查阅。

滤块的选择除考虑荧光探针的激发、发射波长，对于多色标记样品还需考虑是否有非特异激发、是否串色。此外还需考虑所使用的荧光光源，目前常用的荧光光源有汞灯、金属卤素灯，以及近年来飞速发展的LED光源。荧光光源的光谱有连续的和非连续的，在不同波段能量也会不同。LED光源因为其相对较窄的光谱带、更稳定的能量输出、超长的寿命、更安全环保等诸多优点，正逐步成为荧光显微镜的主要光源。

除了显微镜内置的滤块，还有外置快速转轮。

荧光显微成像技术应用广泛，种类丰富，而且新技术还在不断涌现，大家可以选择Z适合的技术去完成自己的研究。