如何制作激光共聚焦显微镜的样品？

制作激光共聚焦显微镜的样品是一个涉及多个步骤的过程，以下是一个清晰的制作流程，结合了参考文章中的相关信息：

1. 组织采集与固定

采集：根据实验条件和目的采集不同来源的组织。

固定：

液氮冷冻法：新鲜组织采集后，直接放入液氮中保存。

多聚甲醛(PFA)固定法：适用于小鼠、大鼠等实验动物的组织。将组织块置于4% PFA中进行后固定，固定的时间可根据组织块的大小和致密程度调整，如4℃固定过夜或室温1～4 h。

2. 组织保存与预处理

洗涤：用0.01 mol/L PBS缓冲液洗3次，每次10～30 min。

脱水：在20%蔗糖中4℃浸泡1 h以上，待组织块下沉后，即可进行后续步骤。

保存：组织块可置于4℃冰箱保存于20%蔗糖(含0.05% NaN₃)中，一个月内完成切片。

3. 冷冻包埋与切片

冷冻：

气体CO₂冷冻包埋法：将组织块放在滤纸上吸取表面液体，放入样品台的冷冻包埋剂(OCT)中，用CO₂气体迅速冷冻组织样品。

液氮冷冻法：将组织块置于样品台的OCT中，先在液氮中迅速浸提几次，直至样品温度与液氮温度平衡，之后移至冷冻切片机中。

切片：使用冷冻切片机，将组织切成5～15 μm的切片，粘贴于处理过的载玻片上。

4. 免疫荧光抗体标记

切片处理：将冷冻组织切片从-80℃冰箱中取出，室温放置10min，待切片回温并干燥，浸于PBS中10min洗去OCT。

标记：无需Triton处理，即可进行免疫荧光抗体标记，操作步骤与培养细胞反应方法相同。

5. 封片与保存

封片：使用抗荧光淬灭的封片剂封片，以减少荧光信号丢失。

保存：4℃保存，等待观察。

注意事项

样品承载物：如观察贴壁细胞或组织切片，可用普通载玻片和盖玻片；如观察悬浮细胞或悬浮粒子，可用共聚焦显微镜专用的培养皿。

染料选择：根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择荧光染料，避免不同荧光染料的发射波长重叠。

通过遵循以上步骤和注意事项，可以制作出适用于激光共聚焦显微镜的高质量样品。